I. Single-cell analyses of MAPK signaling pathways in Saccharomyces cerevisiae using cell chips

나노바이오기술을 이용하여 세포군내 개별세포의 신호전달이 차별성을 가지는지를 단일세포 수준에서 통합적으로 이해하자 한다. 이를 위해 나노기술, 세포 생물학 및 분자 생물학적 연구 기법을 이용하여 효모의 mating과 stress MAP kinase pathway를 모델로 개별세포에서 신호 전달의 활성, signal adaption등의 flux를 시간별로 관찰하여 생물학적 현상의 관찰시 필연적인 ensemble average problem을 규명하고 세포군내 개별세포의 신호전달이 차별성을 가지는지를 규명하고 이를 통해 신호 전달의 제어 및 조절 기작을 다각적으로 이해하고자 한다.

The mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathways is essential for cell growth, cell differentiation and survival in eukaryotes. The mating and high osmolarity responses in the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, depend on the MAPK signaling pathways. We analyzed the mating and high osmolarity responses in the budding yeast, S. cerevisiae at single-cell level using cell chips. Using the technique, we have determined the real-time gene expression patterns of the mating and high osmolarity responses at single-cell level. We observed that the mating and high osmolarity MAPK signaling showed a non-uniform, fluctuating flux in the population of yeast cells analyzed.

II. Functional analysis of PPQ1 in the mating MAP kinase pathway
   in budding yeast

The mating response of the budding yeast upon stimulation by mating pheromone relies on MAP kinase signal transmission. I've identified a PPQ1 as a putative negative regulator of mating signaling using a noble genetic screening method. Now I study on its regulatory mechanisms with several biochemical approaches.

효모에서 짝짓기 신호 전달은 페로몬에 의한 자극을 받아 MAP kinase들의 신호 전달과정에 의해 이루어 진다. 본 실험실에서 고안한 유전적 발굴 과정을 통하여 PPQ1은 이러한 신호 전달의 잠정적 신호 억제자로 생각된다. 따라서 현재는 여러가지 생화학적인 접근을 통하여 PPQ1의 조절 기작을 연구하고 있다.

III. Absolute quantification and profiling of MAPK phosphorylation by Mass Spectroscopy

MAPK pathway는 세포의 성장, 분열, 분화, 사멸 등에 관여하며 진화를 거쳐오는 동안 잘 보존되어져 있는 신호전달과정이다. MAPK pathway는 3단계의 kinase들로 구성되어져 있으며 마지막 단계의 MAPK는 Thr과 Tyr의 인산화를 통해 활성화되고 이것이 신호전달의 스위치역할을 한다. MAPK의 인산화가 일어나는 Thr과 Tyr 부위는 진화적으로도 보존되어져 효모부터 사람까지 모두 동일한 sequence를 갖는다. 하지만 MAPK의 활성화기작에 대해서는 밝혀진 바가 없으며 활성화기작이 진화적으로도 동일한지에 대해서도 아직 밝혀진 바가 없다. 본 연구에서는 예쁜꼬마선충, 초파리, 쥐, 사람을 대상으로 자극을 주었을때 MAPK의 인산화가 어떠한 패턴을 갖는지 절대질량분석방법인 AQUA analysis를 통해 밝히고자 한다.

Mitogen activated protein (MAP) kinase signaling is critical for various cellular responses including cell proliferation, differentiation and cell death. The MAP kinase cascade is conserved in eukaryotic kingdom as three-tiered kinase module; MAPKKK, MAPKK and MAPK. In mammalian cells, extracellular signal-regulated kinases (ERKs) pathway plays an important role in cell growth including cell proliferation and differentiation, and is known to be activated by dual phosphorylation at threonine and tyrosine residues. Like ERK MAP kinase in mammalian cells, Mpk-1, the MAP kinase in C. elegans and dERK, the MAP kinase in drosophila are also phosphorylated at conserved threonine and tyrosine residues during signal transmission. The dual phosphorylation of MAP kinase is known to be essential for catalytic activity and for signal activation, but the mechanism by which the two residues are phosphorylated remains elusive. In this study, we attempted to elucidate the order and magnitude of dual phosphorylation of MAP kinases in mammals, nematode and fly and profiled MAP kinase phosphorylation patterns using absolute quantification by mass spectroscopy

IV.

We examine whether the mammalian scaffold protein could flow the signaling pathway when the one of MAPKK or MAPK is rewired to JIP1 by artificial assembly using a set of PDZ domains, but not by the original interaction between scaffold protein and MAPKs. JIP1, which is the mammalian scaffold protein expressed usually at brain or kidney, mediates the stress activated MAPKinase cascades, the JNK pathway module which is composed of MLK(MAPKKK) - or DLK(MAPKKK) -, MKK7(MAPKK), JNK(MAPK). This experiment would demonstrate that the main role of scaffold protein is the simple tethering of MAPKinase components of cascades, and show the prospect that by this role, the signaling pathway could be manipulated into other outputs in the mammalian as well as yeast.

Mammalian scaffold protein, JIP1의 MAPK 혹은 MAPKK과의 고유한 interaction site에 mutation을 만들고, 이들의 binding을 방해시켜 signaling flow를 막은 상태에서, PDZ domain 들을 이용하여 이들의 interaction을 복구시켰을 때, signaling pathway가 회복되는 지 알아보려고 한다. JIP1은 주로 brain이나 kidney에서 발현되는 mammalian scaffold protein으로서 외부 환경의 stress에 반응하는 JNK를 activation 시키기 위한 MAPKinase cascades에 관여한다. JNK kinase pathways를 구성요소는 MLK(MAPKKK) 혹은 DLK(MAPKKK), MKK7(MAPKK), JNK(MAPK)이다. 이 실험을 통해 scaffold protein의 주된 기능은 pathway의 구성요소들과 결합하여 이들을 모아주는 것이며, yeast에서 이미 증명된 바와 같이, (Park et al. 2003) mammalian cells에서도 이러한 기능을 이용해서 서로 다른 signaling들을 연결하여 새로운 신호자극과 신호전달의 결과를 이을 수 있는 가능성을 보여줄 것이다.

Ⅴ. Rewiring of MAPK signaling cascades

Most of human disease triggers by abnormal protein-protein interaction. Cancer, Alzheimer are most popular example, so therapy of the disease aim at that. However, most approaches are based on chemical compound. Although the chemical compound can disrupt protein-protein interaction very efficiently, they interact with limited protein site. As this result, disease can overcome by some mutation. We focused another approaches peptide interface. Peptide is not limited interaction but interact with broadly. So, they overcome chemical compound restriction. .

caffold 단백질은 MAPK 신호전달을 포함하는 수많은 신호전달 경로에서 중요한 역할을 하는 것이 알려져 있다. Saccharomyces cerevisiae 에서 교배 페로몬과 높은 삼투환경에 대응하는 MAPK 경로는 scaffold 단백질 Ste5와 Pbs2를 각각 필요로 한다. 이 두 경로는 공통적으로 MAPKKK Ste11을 필요로 하지만, 일반적인 상황에서 각각의 신호전달 과정이 다른 편에 영향을 미치지는 않는다. 지금까지 연구를 통해서, 단순히 붙잡아주는 것이 scaffold 단백질의 주요 기능이라는 것을 보여주었다. Scaffold-Kinase 상호작용이 구분되는 역할 단위를 통해 각각 일어나며 단순히 신호전달에 필요한 구성 요소를 붙잡아주는 역할을 한다는 사실을 통해, 원래의 scaffold를 대체하는 인공적인 scaffold를 제작할 수 있을 것이라 생각한다. 우리는 본래의 MAPK signaling에 이용되는 kinase를 특이적으로 붙잡는 PDZ를 이용하여 인공적인 scaffold를 설계하고자 한다. 인공적인 scaffold를 이용하여 MAPK 신호전달을 재구성하는 것은 세포 신호전달 기작을 이해하는데 도움을 줄 것이며, 세포 신호전달의 흐름을 바꾸는 것을 가능케 할 것이다.

Ⅵ. Specific disruption of protein-protein interactions using peptide library-based genetic screening

Protein-protein interactions play a central role in many cellular processes. Many of human diseases are believed to be provoked by dysfunction of protein-protein interactions. Therefore, the ability to interfere with specific protein-protein interactions can provide a new insight for disease therapy and cellular functions of proteins. Peptide could be a good material for blocking of protein interactions because they show high specificity and affinity to their target protein. In this study, a novel genetic screening system was used for selection of disruptive peptides specific for target protein interactions from a combinational library. Components of Ras signaling pathway, APIP and Tau proteins were chosen for screening targets because these proteins are involved in many critical cellular processes and diseases. Ras and APIP pathway are involved in anti-apoptotic processes, and dysfunction of these components is known to promote development of cancer. Tau functions as microtubule stabilizer and promotes microtubule assembly. However, polymerization of dysfunctional Tau generates neurodegenerative disease. To disrupt protein-protein interactions, target proteins were fused to DNA binding domain cI repressor from bacteriophage λ. Reconstitution of a functional repressor via interaction of target proteins was monitored by a reporter module (λPr-LacZ-Tet). Hybrid repressor and combinatorial peptide library were co-expressed in bacterial cells carrying the reporter module and disruptive peptides specific for target interactions were identified.

단백질-단백질 상호작용은 많은 세포 대사활동에서 중요한 역할을 하고 있다. 암, 알츠하이머 병, 파킨스 병과 같은 질병들은 바로 이러한 단백질 상호작용의 이상에서 기인하고 있다. 때문에 이러한 비정상적인 단백질 상호작용을 발생 되는 질병들에 대한 치료법 등을 연구하기 위해서는 특이적으로 이러한 상호작용을 저해할 수 있는 연구방법이 필요하다. 그런데 펩티드는 높은 특이성과 친화력을 가지고 있기 때문에 이러한 목적으로 사용하기 이상적인 물질일 것이다. 그런데 이러한 펩티드를 찾아내기 위해서는 전통적인 진핵세포를 이용한 방법보다는 원핵세포를 이용한 방법이 보다 어울리는 방법일 것이다. 이번 연구에서는 단백질 상호작용을 저해하는 펩티드를 찾아내기 위해 원핵세포를 이용한 선별방식을 사용하였으며 그 대상으로는 Ras, APIP, Tau pathway가 쓰였다. Ras와 APIP은 항 세포자살 과정에 관련되어 있는 것으로 알려져 있으며 Tau는 세포내 미소관의 안정화와 조립을 돕는 역할을 하는 것으로 알려져있다. Ras와 APIP의 기능이 잘못되었을 경우에는 암과 직결될 수 있으며 또한 Tau는 신경퇴행성 질환에 큰 관련이 될 수 있다. 때문에 단백질 잘못된 상호작용들을 저해 할 수 있는 펩티드를 찾아내고 그에 대한 연구를 진행 해 보고자 한다.

Ⅶ. Analyses of MAPK signaling pathways in mammalian cells at single-cell level using cell chips

In mammalian cells, there are three MAPK signaling pathways, such as ERK, JNK, and p38. In this study, we focus on ERK pathway which is closely related with cell proliferation and survival, and analyze it at single-cell level in mammalian cells such as HeLa and Jurkat. In order to accomplish this goal, we adopt a new method called cell chips. This method is suitable to observe signaling responses and kinetics at single cell level, because it can individualize various cell populations and maintain each cell. This research would be helpful to understand a variety of signaling fluxes in the population of mammalian cells.